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睡眠障碍由睡眠中枢的失调引起，包括广泛的全身反应，最终通过神经、血管和内分泌紊乱影响外周器官的功能和状况。由于有限的机制研究，睡眠障碍在牙周炎发病机制中的直接原因或加重作用仍未得到证实。在这项研究中，我们结合实验性睡眠剥夺(SD)和结扎诱导的牙周炎(LIP)来研究SD对牙周炎的影响。随后，电针在远端足三里穴位给予电针。鉴于胆碱能系统与SD病理学和电针治疗的双重相关性，我们假设SD加重牙周炎，而电针通过神经免疫调节胆碱能通路缓解牙周炎。

1. SD加重LIP及电针的缓解作用

通过整合数据库中睡眠和牙周的数据，我们发现，与健康队列相比，睡眠障碍患者表现出更高的牙周临床依恋损失，而在探测深度方面没有观察到显著差异(图1a)。表明牙周炎的加重可能与睡眠障碍有关。为了探讨睡眠障碍对牙周炎的影响并评估电针的治疗效果，我们通过对体重、血清皮质酮水平和行为评估等全面评估，成功建立了结扎诱导的牙周炎合并睡眠剥夺(LIP+SD)的小鼠模型(图1d，e)。随后，在该模型中引入电针作为一种潜在的治疗干预措施(图1b，c)。显微CT图像显示，SD加剧了LIP小鼠的牙槽骨吸收，而电针有效地减轻了SD加剧的吸收(图1f)。

为了证实牙周组织中有破骨细胞的激活这一假设，进行了TRAP染色。与LIP组相比，LIP+SD组牙周破骨细胞在牙槽骨中散在聚集(图1h)。随后，我们在转录水平上分析了所有组的TRAP表达，揭示了与TRAP染色结果一致的趋势(图1I)，而IL-17a的表达水平无明显变化(图1J)。

图1 睡眠剥夺(SD)加剧了结扎诱导的牙周炎(LIP)小鼠的牙槽骨吸收和炎症反应，而电针(EA)刺激延缓了这一过程。

2. SD大鼠牙周组织中α7nAChR表达的定位异常

为了更深入地研究SD如何加重牙周炎和电针的治疗机制，我们对先前报道的显著的血清神经递质进行了筛查。结果表明，儿茶酚胺途径的神经递质，如多巴胺、肾上腺素和去甲肾上腺素，没有显著变化(图2a)，因此暗示CAP在调节电针治疗的效果中具有特定的作用。此外，为了建立全身神经递质和局部牙周炎之间的联系，我们分析了来自人类蛋白质ATLAS的数据，发现只有三种ACh受体在牙周组织中表达(图2b)。通过qPCR进一步验证这些受体，发现只有CHRNA7在LIP+SD组中的表达比LIP组降低，而在EA组中增加(图2c)。同样，在蛋白质水平上分析显示出与qPCR结果一致的趋势(图2d)。这些结果共同提示SD与α7nAChR下调和EA上调α7nAChR有关，突出了CAP在睡眠剥夺牙周炎中的重要性。

为了进一步阐明α7nAChR的作用，我们对SD+LIP组和SD+LIP+EA组应用了药理学药物，当GTS-21或MLA与EA联合使用时，发现GTS-21抑制骨吸收的进展，而MLA加剧骨吸收(图2f，g)。为了深入了解其潜在机制，我们检测了牙周组织中的炎性细胞因子。与LIP+SD+GTS-21组相比，LIP+SD+EA+GTS-21组的促炎细胞因子(IL-6等)水平显著降低，IL-10水平显著上调。而LIP+SD+MLA组与LIP+SD+EA+MLA组之间无明显差异(图2h)。SD和EA共同通过抑制/激活CAP介导的α7nAChR发挥作用。

图2 SD和EA的作用是通过抑制/激活胆碱能途径中的α7nAChR来实现。

3. SD通过下调牙周巨噬细胞α7nAChR和增强三叉神经节AChE来加重LIP

通过牙周免疫荧光染色，我们观察到LIP+SD组α7nAChR的下调可能与F4/80+细胞，特别是巨噬细胞有关(图3a)。在巨噬细胞耗尽后，LIP+CL组的α7nAChR水平显著降低(图3b)。同时，LIP+SD组小鼠的牙周组织和血液样本的流式细胞术分析显示，牙周组织中的巨噬细胞减少，但单核细胞没有减少(图3c-e)。这些发现共同表明α7nAChR的表达与牙周组织中的巨噬细胞之间存在特定的关联。

在小鼠牙周组织中，我们发现与LIP组相比，LIP+SD组的ACh水平下降，同时AChE水平显著上升(图3f)。最重要的是，我们还观察到，与PD组相比，PS组的人唾液和血液样本中ACh含量降低，AChE水平上升(图3g，h)。这些结果表明SD时ACh的表达受到破坏。总之，东南亚音乐特点这些发现提示SD对LIP的调节可能有神经机制参与。

图3 SD通过下调牙周巨噬细胞上的α7nAChR和增强三叉神经节的AChE而起作用。

4. 三叉神经节源性AChE抑制牙周巨噬细胞胆碱能信号

为了探讨神经元AChE是否影响巨噬细胞上的α7nAChR，我们首先用AChE质粒过表达HT22神经元细胞，然后用两种共培养方法，共同培养HT22神经元细胞和RAW264.7巨噬细胞(图4a)。我们的研究发现，在两种培养条件下α7nAChR+RAW264.7细胞的比例都降低(图4b，c)。然后，我们在炎症环境中直接给予AChE重组蛋白处理RAW264.7，再次发现α7nAChR+细胞率显著降低(图4d)，并能够促进CD86+细胞率的增加(图4e)。

此外，我们通过注射表达绿色荧光蛋白的AAV(GFP-AAV)建立了对照组(图4g)。两周后，我们收集三叉神经节，在显微镜下观察它们的AAV介导的荧光。我们发现两个AAVs被成功地注射到LIP+SD小鼠的三叉神经节(图4h)。然后，通过Micro-CT和组织学分析，我们发现AChE-AAV组的牙槽骨吸收和破骨细胞活性明显低于GFP-AAV组(图4I-L)，而对侧的牙槽骨吸收与GFP-AAV组没有差异。

图4 SD通过三叉神经通路中的AChE影响牙周巨噬细胞上的CAP。

5. 电针诱导的α7nAChR激活逆转巨噬细胞促炎极化

下一步，我们旨在探讨电针治疗LIP+SD的机制。首先，我们收集了五组牙周组织，制备了单细胞悬液用于流式细胞术(图5a)。结果显示，中性粒细胞、巨噬细胞和新募集的巨噬细胞比例在疾病组增加，电针后比例降低；树突状细胞和单核细胞无明显变化(图5b)。然后，我们进一步观察了中性粒细胞、巨噬细胞和新招募的巨噬细胞中α7nAChR+细胞的比例(图5c)，发现相对于LIP组，只有巨噬细胞上的α7nAChR+细胞减少，而电针后α7nAChR+细胞增加(图5d)，这表明EA α7nAChR特异性地作用于巨噬细胞。然后，牙龈免疫荧光染色证实了这一趋势(图5e)。

此外，我们还收集了细胞上清液用于ELISA，发现给予ACh或GTS-21后，我们发现，在给予ACH和/或GTS-21后，巨噬细胞的M1极化被抑制，而M2极化被促进，而在MLA注射后观察到相反的趋势(图5g)。此外，还发现，ACh或GTS-21单独给药后，巨噬细胞的促炎因子IL-1、IL-6和iNOS的下降不明显，但两者联合应用可显著降低促炎因子，并抑制巨噬细胞的M1极化，促进M2极化(图5h，I)。以上结果提示，电针通过激活巨噬细胞表面α7nAChR抑制炎症反应。

图5 电针通过激活牙周巨噬细胞上的α7nAChR发挥抗炎作用。

结论

综上所述，本研究报告了AChE-ACh-α7nAChR轴在睡眠剥夺模型和电针针对这一途径的牙周病炎症反应和神经免疫相互作用中的调节作用。我们的数据表明，SD通过增加牙周组织中三叉神经节源性AChE，减少ACh与α7nAChR的结合来抑制胆碱能抗炎途径，从而抑制牙周炎，而EA激活胆碱能抗炎途径，并部分逆转这一作用。本研究结果阐明了睡眠剥夺影响周围神经炎症的机制，有助于睡眠剥夺所致牙周炎的靶向治疗。

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